病害名称8种杀菌剂对柠檬黑星病原菌的室内毒力测定
关键词 杀菌剂、柠檬、黑星病、毒力测定
发生规律
柠檬(Citrus limon)属芸香科柑桔类常绿水果，具有重要的调味和深加工价值。素有中国柠檬之乡的四川安岳，已将柠檬种植作为发展当地经济的重要支柱产业，其产品远销朝鲜?俄罗斯和蒙古等国。近年来，病虫害的大面积发生，尤其是黑星病的蔓延，严重制约了该地区柠檬产业的发展。吕良琼等?曾利等和肖育贵等对柠檬黑星病的发生及防治进行研究发现，该病害主要危害果实和叶片，在发病部位常滋生红褐色或黑褐色的小黑点，对产量和果实的品质均有较大影响，降低柠檬的固有商品价值。如何有效防治柠檬黑星病的发生与危害，对促进该地区柠檬产业的健康?可持续发展显得尤为重要。目前，药剂防治仍是最为重要的方法之一，但国内在该病菌的药剂筛选和防治方面的研究报道较少，为此，笔者等于2010年9月选取8种生产中常用的杀菌剂及比较新型的杀菌剂对柠檬黑星病进行了室内毒力测定，以期筛选出高效?低毒?低残留的药剂用于该病害的田间防治。
①培养基制备
PDA培养基。将去皮的马铃薯200克切块，加水1000毫升，煮沸约30分钟，用干净纱布滤去残渣，在滤液中加入葡萄糖15克和琼脂20克，加热至琼脂完全融化，加蒸馏水补足至1000毫升，分装在250毫升三角瓶中(150毫升/瓶)于121℃条件下湿热灭菌30分钟。
含药培养基。将供试药剂分别用无菌水稀释至所需浓度的10倍，以1∶9的比例与PDA培养基进行混匀，即可配制所需浓度梯度的含药培养基。
②病原菌的分离纯化 选取带有典型病斑的叶片，用蒸馏水冲洗干净，在病健交界处剪取3毫米3毫米大小的组织块，依次在70%的酒精中浸洗3－5秒，0.1%的升汞中消毒30－45秒，然后在灭菌水中连续漂洗3次，去除残余的升汞，最后用灭菌的吸水纸吸去多余的水分，放在事先准备好的PDA平板上于25℃恒温培养箱中培养。72－96小时后形成菌落，切取典型菌落边缘的菌丝块，移植到新的PDA平板培养基上培养获得分离物的纯培养，转入试管，于4℃冷藏箱中保存备用。
③病原菌的形态学观察与鉴定 将病原菌接种到PDA平板培养基上，于25℃恒温培养箱内连续培养6天，观察其菌落形状?颜色，并从菌落上挑片镜检，观察菌丝?分生孢子形态?色泽并测量其大小。
④毒力测定 将病原菌接种到PDA平板培养基上，于25℃恒温培养箱内培养4天活化备用。采用生长速率法测定供试药剂对柠檬黑星病的毒力大小。将供试所用8种杀菌剂用无菌水稀释，每种杀菌剂设5个浓度梯度(浓度梯度见表1)，每一浓度重复3次。各取1毫升药液分别加入到温度降至40℃左右的灭菌定量(99毫升)培养基中，摇匀后倒入直径90毫米的培养皿中，每皿20毫升制成平板，以添加1毫升无菌水的PDA平板为空白对照。选取培养6天的病原菌菌落，打取直径为5.0毫米的菌饼(选取菌落边缘生长旺盛的菌丝)，移入含药PDA平板培养基中央(带菌丝的一面接触培养基)，置25℃培养箱中培养。6天后用十字交叉法测量菌落直径大小，并求出相对抑制率，转换为抑制几率值。将抑制几率值作为依变量(y)，每个浓度值的对数值作为自变量(x)，利用最小二乘法建立回归方程式y=ax+b，再利用此方程式求得抑制中浓度(EC50)，并用Excel和SPSS软件计算每个回归方程式相关系数r和斜率。
2．结果与分析
(1)柠檬黑星病原菌的分离鉴定
将病原菌纯化于PDA培养基上25℃培养6天，菌落直径达65毫米，菌落圆形?扩展状，初为橘红色，后变为褐色；菌丝初无色，放射状生长。在光学显微镜下用1040倍观察病原菌菌丝，明显可见菌丝有隔，呈细长状。分生孢子椭圆形，单胞，无色，大小为7－10微米4.5－8.0微米。经鉴定，该病原菌为球壳孢目(Sphaeropsidales)茎点霉属(Phoma)真菌。
(2)8种杀菌剂对柠檬黑星病原菌的抑制作用
通过生长速率法测定，8种药剂在给定浓度范围内对该病原菌菌丝的生长均有不同程度的抑制。比较各药剂的抑制率大小发现，随着各种药剂浓度的增加，抑制率也随之增大，75%百菌清WP的使用浓度从5微克/毫升依次增加到80微克/毫升，其抑制率相应由10.23%增大至35.15%；300克/升爱苗EC使用浓度由0.05微克/毫升依次增加至10微克/毫升，其抑制率相应由36.3%增大至85.64%。比较分析其他6种药剂的抑菌率，各药剂浓度均与抑菌作用呈正相关关系。
(3)8种杀菌剂对柠檬黑星病原菌的毒力差异性
8种供试杀菌剂的浓度与抑菌率的相关系数均达到显著水平，呈线性相关。研究表明，EC50值可用来比较不同杀菌剂对供试菌株的毒力强弱。8种药剂对柠檬黑星病病原菌菌丝的抑制效果不同，其中，300克/升爱苗EC的抑菌作用最强，其EC50仅为0.0678微克/毫升；25%咪酰胺EC和50%施保功WG的抑菌作用次之，EC50为1.0001微克/毫升和1.9073微克/毫升；10%苯醚甲环唑WG?1%武夷菌素AS?12.5%烯唑醇WP和25%咪菌酯SC也有较好的抑菌效果，其EC50分别为10.1016微克/毫升?38.4791微克/毫升?72.3156微克/毫升和80.2374微克/毫升；75%百菌清WP的效果最差，其EC50为368.7724微克/毫升。
3．结论与讨论
(1)根据菌落特征?分生孢子及菌丝形态，结合发病症状，初步鉴定引起四川安岳地区柠檬黑星病的病原菌为球壳孢目(Sphaeropsidales)茎点霉属(Phoma)真菌。分离到的病原与肖育贵等[11]的研究结果基本一致，进一步证实柠檬黑星病的发生与茎点霉属有关。
(2)试验结果表明，8种杀菌剂对柠檬黑星病原菌丝均有不同程度的抑制作用。从EC50数值来看，不同杀菌剂的毒力依次为300克/升爱苗EC25%咪酰胺EC50%施保功WG10%苯醚甲环唑WG1%武夷菌素AS12.5%烯唑醇WP25%咪菌酯SC75%百菌清WP。其中，300克/升爱苗EC(苯醚甲环唑丙环唑)对菌丝的抑制效果最好，其次为25%咪酰胺EC和50%施保功WG，以上3种药剂可进一步进行大田试验，具有推广应用的价值。从试验结果看，10%苯醚甲环唑WG仍有一定的杀菌效果，而1%武夷菌素AS是生物杀菌剂，具有低毒?低残留?持效期长等诸多优点，也有较好的杀菌效果，因此，这两种药剂也具有一定的推广实用价值；75%百菌清WP对柠檬黑星病原菌丝室内毒力测定效果较差，不建议进行大田使用。
(3)本研究采用病原菌菌丝生长速率法进行毒力测定，未涉及药剂对孢子萌发?附着胞的形成与定植?植株生长，以及药剂本身理化性质在自然环境中的稳定程度等方面的研究，因此，以上几种推荐药剂的实际毒力及防效还需进一步实施田间试验。为延缓柠檬黑星病原菌抗药性的产生，建议筛选的几种高效杀菌剂进行混配使用或交替使用。
